基質水平磷酸化
基質水平磷酸化（英語：substrate-level phosphorylation）是指一類ADP或其他核苷二磷酸的磷酸化作用與基質的脫氫作用直接相偶聯的反應過程。
除了發生在糖酵解和三羧酸循環之中的基質水平磷酸化之外，製造腺苷三磷酸的另一條路徑是氧化磷酸化作用，這一作用發生在細胞呼吸的過程之中。在氧化磷酸化期間，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸被氧化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，生成2.5分子的腺苷三磷酸，而還原黃素腺嘌呤二核苷酸被氧化時則生成1.5分子的腺苷三磷酸。氧化磷酸化利用跨線粒體膜的電化學或化學滲透質子梯度以生產腺苷三磷酸，這點是與基質水平磷酸化之間最大的不同。
不像氧化磷酸化，氧化與磷酸化這兩個過程在基質水平磷酸化過程中並未聯繫在一起，儘管這兩種磷酸化都會使得腺苷三磷酸生成並且在分解代謝的氧化過程中常會得到活性中間體。然而通常情況下多數的腺苷三磷酸是在有氧或無氧呼吸的氧化磷酸化過程中形成的。基質水平磷酸化充當腺苷三磷酸的快速來源，而不依賴額外的電子受體以及呼吸作用。這種情況例如人類紅血球，其中沒有線粒體，或是缺氧狀態下的肌肉細胞。基質水平磷酸化的主要部分發生在細胞質中，為糖酵解的一部分；以及在有氧與無氧環境中的線粒體中，為三羧酸循環的一部分。
糖酵解和三羧酸循環中的基質水平磷酸化
在糖酵解的放能階段，基質水平磷酸化生成了四分子的腺苷三磷酸：其中兩分子是在1,3-二磷酸甘油酸轉變為3-磷酸甘油酸的過程中被磷酸甘油酸激酶將磷酸基轉到腺苷二磷酸上的；另外兩分子是在磷酸烯醇式丙酮酸轉變為丙酮酸的過程中被丙酮酸激酶將磷酸基轉到腺苷二磷酸上的。第一步是在3-磷酸甘油醛與一分子的無機磷酸被磷酸甘油醛脫氫酶轉變為1,3-二磷酸甘油酸之後發生的。在接下來獨立的步驟（區別於氧化磷酸化的重要步驟）中，通過磷酸甘油酸激酶的作用，將1,3-二磷酸甘油酸分子上的高能磷酸基團轉移到腺苷二磷酸上，生成3-磷酸甘油酸。因為腺苷三磷酸從無機磷酸基團中生成出來，此步驟導致了糖酵解過程中的能量收穫。第二個基質水平磷酸化在之後發生：在丙酮酸激酶的作用下通過磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）反應而生成丙酮酸。此反應重新生成了在糖酵解準備階段用於將葡萄糖活化為葡萄糖-6-磷酸以及將果糖-6-磷酸活化為果糖-1,6-二磷酸而耗去的腺苷三磷酸。（即糖酵解10步反應中的第7步和第10步）
一旦糖酵解的產物丙酮酸進入線粒體基質，丙酮酸就被轉變為乙酸酯並結合到輔酶A上以生成乙酰輔酶A並進入三羧酸循環。然而三羧酸循環是需氧呼吸，基質水平磷酸化的另一個例子就發生在琥珀酰輔酶A轉換為琥珀酸時，鳥苷二磷酸通過被轉上一個磷酸基團而生成了鳥苷三磷酸（GTP）。此磷酸基團在另一個基質水平磷酸化事件中被轉移到腺苷二磷酸上。催化此反應的酶是琥珀酰輔酶A合成酶。（即三羧酸循環8步反應中的第5步）
其他機制
在工作的骨骼肌和大腦中，磷酸肌酸作為一種便利現成的高能磷酸鹽供應被儲存起來，肌酸磷酸激酶將磷酸基團從磷酸肌酸轉移到腺苷二磷酸上而生成腺苷三磷酸。接着腺苷三磷酸釋放所匯存的化學能。這有時被錯誤地認為是基質水平的磷酸化，儘管它是轉磷酸化。